LUNA FL 荧光细胞计数仪荧光模式计数注意事项

LUNA FL 荧光细胞计数仪是韩国Aligned Genetics公司旗下Logos Biosystems 品牌的经典细胞计数仪产品，具备了明场计数、荧光计数，酵母计数以及GFP转染效率计算等功能。该产品小巧便携，计数准确，应用广泛，是开展基础研究，单细胞测序，干细胞生产以及药物研发和基础医学研究等领域的实用工具。

根据以往多年经验，合并众多用户使用中经常遇到的几个问题，我们针对荧光模式细胞计数总结出以下几点注意事项，以供广大使用者参考。

1. 关于细胞计数过程中AO/PI 的染色时效问题

   AO/PI具有很好的亲水性，在染色过程中，染料会在加入之时迅速进入细胞与细胞内的核酸结合，因此不必担心细胞染不上色的问题。

   需要说明的是，根据AO和PI 的分子特性， AO是可以快速穿透细胞膜进入所有细胞。而PI无法穿透完整的细胞膜，只能在细胞膜有破损的情况下进入细胞内部，因此只能染死细胞。

   关于AO/PI染色进行细胞计数的工作原理，请参见产品说明书。

2. 关于细胞计数时激发光强度的问题

  由于细胞荧光计数时是通过绿色通道（GFP）和红色通道（RFP）以及明场通道下图像叠加后综合分析的结果。GFP通道和RFP通道的荧光信号强弱会影响到后续算法的准确性。因此两个通道的荧光信号不可过强，也不可过弱。

在使用原厂的预混AO/PI荧光染料的前提下，绝大多数细胞的经验值就是GFP和RFP通道的激发光强度分别是5,  但是，有很多情况下，同样的激发光强度，RFP通道的信号会偏弱，因此，经验值推荐是RFP通道的激发光强度比GFP通道的高一档。

3. 关于细胞荧光计数时的时间问题

   由于荧光计数时，需要分别拍摄明场，GFP, RFP三色通道的图片，涉及到滤光片的切换，因此计数时间会比明场计数要长，平均的计数时间是45-50秒。另外，细胞浓度，均一度的变化也会影响计数时间，浓度太高会增加计数时间，甚至会报错。

4. 关于细胞计数前的静置问题

   由于细胞不同的通道在拍摄时会有先后顺序，如果细胞没有完全静止，拍摄过程中会产生错位，产生错位的细胞会影响计数的准确性。因此需要在计数前进行充分静置。常规的哺乳动物细胞，加样后静置5-10秒就可以观察到静止不动。对于直径偏小的细胞或者比较干燥的环境条件，有可能需要更长的静置时间。  

   细胞静置不动可以在实时预览界面观察。

5. 关于荧光计数时的荧光阈值调节问题

  在protocol中，有两个荧光阈值的参数，分别是GF和RF的阈值。这两个阈值提供了一个细胞荧光计数的界限，低于这个阈值的，会被排除在外。   默认的protocol中，两个阈值分别是5，根据个人的经验，如果细胞比较浓，信号强度有强有弱，可将该阈值降低到2或者3，这样可以把足够多的细胞计算在内。也可以通过这种方法，把一些信号比较弱的排除在外，比如一些细胞器；线粒体，高尔基体，它们都含有核酸，也是可以被染色的，但是染色后，它的信号强度总体会比细胞弱，直径也偏小，可以通过设置荧光阈值的方式排除掉。

6. 如何判断荧光激发光强度的最佳值

  过强的荧光信号会产生光晕，也会导致GFP和RFP的叠加后真实信号有差异，造成细胞活率计算出现偏差。绝大多数细胞的激发光强度参考5， 个别细胞可以根据实际情况来调节。个人的经验是，以当下激发光强度为准，增加一档会出现信号的显著增加，减小一档，会出现信号显著减小，此为最佳的激发光强度。

                                                         技术咨询电话：15810208710 张先生