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利用LUNA FL荧光计数仪 来计算植物原生质体的活率
1. 概述：
单细胞测序技术是目前生命科学研究的一个热门方向，它可以揭示出每个细胞独特的微妙变化，甚至可以揭示全新的细胞类型。它极大地推进了基因组学领域，使不同细胞类型得以精细区分，使得科学家们在单细胞水平进行分子机制研究成为可能。
在进行单细胞测序前处理的过程中，对细胞活率的评价至关重要，植物原生质体是一类特殊的细胞膜包被的细胞，由于在制备过程中需要要酶解植物细胞壁，在酶解后溶液中会存在一些多糖颗粒，同时，由于植物细胞内含有大量叶绿体，叶绿体中的叶绿素存在强烈的自发荧光，除此之外，植物细胞内还或多或少含有一些淀粉粒，这些多糖颗粒，游离的淀粉粒和叶绿体会干扰植物原生质体的计数准确性和活率。
2. LUNA FL 简介
韩国Aligned Genetics公司旗下的Logos biosystems品牌的LUNA FL自动荧光计数仪具有双通道荧光计数功能和明场计数功能，采用LED光源激发，5百万像素CMOS成像分析，可用来进行常规连续培养细胞系的台盼蓝染色计数，也可用于原代细胞，淋巴细胞，肿瘤细胞，干细胞，藻类以及其他难以准确计数的细胞的准确计数。同时还支持GFP细胞的转染效率的计算，以及酵母细胞的自动计数。
利用LUNA FL 强大的软件参数设置功能，既可以设置细胞的最小直径，又可设置细胞最大直径，同时在计数结束后还可以通过后调节功能来改变计数的直径范围，实现再计数。除此之外，它还可以在计数的protocol中设置荧光检测的阈值，也可以在计数前调节荧光激发光的强度，从而得到理想的准确的计数结果。
3. 植物原生质体预实验
植物原生质体是一类比较独特的细胞，它细胞内部含有大量的叶绿体和少量的淀粉粒，由于它缺乏植物细胞壁的支撑，容易破裂，破裂后，叶绿体和淀粉粒会游离到悬浮溶液冲，在明场下观察观察到了大量的明显小于植物原生质体的颗粒。这些颗粒会严重干扰计数结果，产生巨大的偏差。在自动计数过程中，如果不能灵活运用LUNA FL的荧光计数参数调节功能，则很容易出现实验结果异常而导致计数失败。
由于植物原生质体中含有叶绿体，它具有自发荧光，为此，进行了两部分预实验，首先进行不染色的验证试验，目的是检验植物原生质体是否含有自发荧光。分别进行了Green通道和Red通道下的荧光成像实验。结果发现只有Red荧光通道下有强烈的自发荧光，从而证实了植物原生质体内强烈的自发荧光信号，这些荧光信号严重干扰了植物原生质体的真实计数结果，表现出来的是细胞活率超低，仅在0-10%徘徊。
根据初步测试的结果，调节protocol中的最小细胞直径为15um，最大细胞直径为90um,通过此法调节，来消除游离出来的叶绿体对原生质体计数造成的干扰。
在此情况下，显然利用Logos biosystems 原厂自带的双荧光染料AO/PI 不能适用此类细胞的计数，因此考虑采用FDA做为活细胞染料来进行活细胞检测，而与此同时利用植物原生质体的自发红色荧光和FDA 组成荧光信号进行图像叠加成像来进行活率和总数的计算。
4. FDA溶液制备及染色操作
FDA是荧光素二乙酸酯，它本身没有荧光，没有极性。可透过完整的原生质体膜。一旦进入原生质体内部后，通过酯酶水解，产生荧光素，具有极性，不能自由出入原生质体膜。就会在细胞内发出强荧光，死细胞不具备完整细胞膜，不能被染上绿色荧光，而细胞外的FDA只有较弱的背景荧光信号。
FDA 溶液是提前预配好的，母液是2mg/ml的丙酮溶液，4℃避光保存，使用前将母液稀释1000倍，按18:2比例(细胞悬液：FDA)取18ul植物原生质体悬浮液，加入2ul稀释后的FDA染料，轻微混匀后，放置37℃或室温避光孵育10-15min。
5. FDA+叶绿素法检测植物原生质体活率
经在Green 通道下观察，能够观察到明显的绿色荧光。经初步测试，发现绿色荧光信号远不如叶绿素的红色荧光信号强烈，导致在图像叠加时，绿色信号被红色信号淹没了，只能看到橙色信号。这样仍然得不到正常的细胞活率结果。
为解决这一问题，将红色荧光的激发光强度降低到2，将绿色荧光的激发光强度维持在6，进行重新计数，得到如下图像所示的结果，从图中可以看到经调节Red 通道下激发光的强度后，活的原生质体发出正常的绿色荧光，而少量破碎的细胞或者死的原生质体依然发出红色荧光。得到红绿比例合适的图像，最终得到活率高达72%的叠加图像信号。
利用LUNA FL软件上的Image 栏目下的Tag 功能按键，可通过软件很直观地判断哪些细胞被标记上绿色圆圈（活细胞），哪些被标记上红色圆圈（死细胞）。最后在仪器左侧插入U盘后，可将LUNA FL拍到的所有图片，分析的结果等数据输出保存。
6. .结论：
利用LUNA FL 荧光计数仪成功地实现了植物原生质体总数和活率的计算，在实验过程中需要针对植物原生质体的特性进行相应的参数调整，LUNA FL荧光计数仪强大的参数自定义功能使得实验人员能够灵活处理了实验中的个性化问题，可在30秒内让实验者轻松获得准确的可靠的实验结果。
7. 讨论：
1. FDA是需要在细胞酯酶的酶解作用下才能生成荧光素，因此温度和PH值对酶解的效率影响较大，在当前的室温下，酶的活性并不是最佳的，最好放置在37℃孵育。
2. FDA 水解后产生的荧光素在激发光的长时间激发下，会发生荧光淬灭现象，因此在检测绿色荧光信号时，会发现荧光信号会逐渐减弱，因此建议向原生质体悬液中加入FDA后要避光孵育，同时，样品上样完毕后，尽可能在2分钟内完成计数实验。
3. 本次实验考虑到维持植物原生质体的渗透压，植物原生质体悬浮在MMg buff （pH=5.7）中.
4. 本次实验制备的原生质体采用的是药用植物 长春花，夹竹桃科，并不是常见的模式生物，因此更多的原生质体活率实验有待观察。
5. 由于原生质体叶绿素荧光信号超强，需要调节激发光强度，绿色荧光的激发光强度适当调高，而红色荧光的信号适当调低，目的是是产生的绿色荧光和红色荧光强度匹配，均等，能够在叠加后出现绿色信号和红色信号。
6. 由于原生质体比较脆弱，直径也比较大，因此不能用吸头反复吸打，只需要加入染料后，轻轻摇晃震荡就可以了。另外，原生质体悬液中会有很多直径比较小的颗粒，这些是游离的叶绿体，他们也能发红色荧光，这会对原生质体总数和活率造成干扰，需要通过调节protocol中的最小细胞直径来排除掉。
8. 致谢！
本次实验过程得到了中国医学科学院药用植物研究所孙超老师实验室的大力支持！他们为此次实验提供了实验场所和实验材料，在此对孙超老师和实验室的李益同学致以深深的谢意！
9. 参考资料
2. LUNA FL operating manual
3. 黄静，赵琦,李楠等. 烟草原生质体活力检测和细胞染色方法研究.首都师范大学学报（自然科学版），2007,28(4):42-45
技术联系：15810208710 张先生
